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褐藻糖膠的免疫調節作用
楊曉林
孫菊云 許漢年
劉曉慧 張翼伸
張紹倫
（白求恩醫科大學
長春 130021）
摘
要 觀察了從海帶中提取的褐藻糖膠對小鼠免疫功能的影響。褐藻糖膠在體外可誘導白細胞介素-1（IL-1）和丙型干擾索(IFN-γ)產生；體內給藥可增強T細胞、B細胞、巨噬細胞(Me)和自然殺傷細胞(NK細胞)功能，促進對綿羊紅細胞(SRBC)的初次抗體應答。
關鍵詞
褐藻糖膠；免疫調節
文獻報道，褐藻門(Phaeophyte)一些藻類的多糖成分有明顯的抗腫瘤作用[1-3]．但有關其免疫效應的研究則報道甚少，本研究初步觀察了從海帶中提取的褐藻糖膠對小鼠免疫功能的影響，對其作用機制進行探討，為褐藻多糖類免疫調節劑的深入研究和海藻資源的綜合開發利用提供實驗依據。
1
材料與方法
1.1 實驗動物
C57 BL/6進交系小鼠，18～22g，雌雄不限；Swiss小鼠，18～25g，雌雄各半。均由本校實驗動物部提供．
1.2 褐藻糖膠 (Funcoidan，FCD)
FCD是從產于渤海灣海帶(Laminariu
japonica Aresh)中提取的一種水溶性多糖[4]粉末，體內用藥時用生理鹽水配制，體外實驗用藥時用IMDM培養液配成所需濃度。采用加熱(60℃～80℃
2h)或微孔濾膜(0.22～0.45μrn)除菌后備用。
1.3 主要試劑
IMDM培養基；GIBCO產品；Con A：Sigma產品；植物血凝素(PHA)，上海醫學化驗所；細菌脂多糖(LPS)：本室自制；3H-TdR：中科院北京原子能研究所。
1.4 病毒和細胞株
濾泡性口炎病毒(VSV)：本校第一臨床學院傳染科提供；YAC-1細胞株：醫科院基礎所免疫室惠贈；L929細胞株：軍科院流研所惠贈。
1.5 實驗方法
1.5.1 IL-l和IL-2的誘生及活性測定
參照文獻[5,6]方法進行。
1.5.2 1FN的誘生及活性測定
參照文獻[7]，采用L929(VSV)系統測定其活性，按直接插入法計算效價。
1.5.3 脾細胞介導的SRBC溶血分光光度計定量測定法（QHS)
參照文獻[8]。
}
1.5.4 NK細胞活性檢測[9]
1.5.4.1 效應細胞
無菌制備小鼠脾細胞懸液，低滲法破壞紅細胞后，用培養液調細胞數為1×107/mL或2×107/mL。
1.5.4.2 靶細胞標記
取連續傳代3d以上生長狀態良好的YAC-1細胞配成1×106/mL，加入3H-TdR
25μCi/mL，經37℃溫育4h，每30min振蕩一次，標記后細胞用培養液洗3次，調細胞數為1×105/mL。靶細胞標記率一般可達0.3～0.6cpm/細胞。
1.5.4.3 活性測定
采用96孔培養板，效靶比100:1。體外實驗時實驗孔加入不同濃度的FCD50μL(2.40～3.75μg/mL)，設Con
A、LPS和陰性對照孔，每孔加入標記細胞1×104/100μL，再加效應細胞1×106/50μL。體內給藥實驗時，每孔加標記細胞后，再加效應細胞1×106/100μL，體內、外實險均設靶細胞對照，以培養液代替效應細胞。置CO2孵箱培養24h，收獲細胞測定cpm值，結果以百分率表示，按下列公式計算：
自然釋放率=（1—自然釋放孔cpm/總釋放孔cpm）×100%
特異性釋放率=(1—實驗孔cpm/自然釋放孔cpm)
×100%
2 結果
2.1 誘導和促進IL-l產生
2.1.1 Me在體外經不同濃度FCD作用48h，IL-l樣活性物質的分泌明顯增強(表1)。30μg/mL以上濃度的FCD與LPS10μg/mL的作用相近。
表1
FCD在體外誘導小鼠腹腔Me產生IL-l
|
培養條件
μg/mL
|
IL-l活性
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3H-TdR摻入（cpm，x±s）
|
|
培養液稀釋濃度
|
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1:20
|
1:40
|
1:80
|
|
IMDM
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5892±1332
|
9374±1854
|
8067±1620
|
|
LPS(10)
|
12207±2063
|
11014±2207
|
13263±1784
|
|
FCD(240)
|
10614±1784
|
12342±5724
|
15793±2877
|
|
(60)
|
|
13992±1595
|
13900±212
|
|
(30)
|
13350±1536
|
12289±2896
|
10430±2805
|
|
(15)
|
10630±513
|
12262±2406
|
6128±3252
|
|
(7.5)
|
10714±2715
|
11084±2401
|
5998±1252
|
注：胸腺細胞對照 cpm=
270±53
Con A對照（胸腺細胞+Con
A）cpm = 5768±1856
2.1.2 小鼠皮下注射FCD[10mg/(kg·d)]
9d后，腹腔Me產生IL-l樣活性物質的能力增強，給藥組動物腹腔Me，培養48h，培養上清液在1:80稀釋時可使胸腺細胞3H-TdR摻入值提高39%
(P<0.05)。
2.2 增強NK細胞活性
2.2.1 在FCD對靶細胞(YAC-1)無明顯毒性的濃度范圍內，體外觀察其對小鼠脾臟NK細胞的作用，FCD3.75～240μg/mL均表現為激活NK細胞的效應，特異性釋放率增加7%～16%，最佳濃度為30μg/mL，480μg/mL濃度時則表現為抑制作用。
2.2.2 小鼠皮下注射FCD
9d后，檢測其脾臟NK細胞活性，在2.5、5、10mg/(kg·d)劑量時NK細胞活性顯著增強(P<0.05)，在20mg/(ke·d)劑量時NK活性受列抑制(P<0.01)。
2.3 增強絲裂原誘導的增殖反應
給小鼠連續皮下注射FCD
9d后，觀察脾細胞對絲裂原(Con A、PHA、LPS)的反應性，結果如表2所示，FCD在0.25～10mg/(kg·d)劑量范圍內均表現有增強作用，以5mg/kg為最佳劑量，20mg/kg劑量時無明顯作用。
表2
FCD在體內給藥對有絲分裂原誘導增殖反應的影響
|
組別
（mg/kg）
|
No
|
3H-TdR摻入（cpm，x±s）
|
|
有絲分裂原
|
|
——
|
Con A
|
PHA 2.5
|
LPS 15
|
|
Control
|
4
|
1739±311
|
15189±5082
|
7255±889
|
10223±3847
|
|
0.25
|
4
|
2409±785
|
17602±6462
|
14046±3583a
|
13335±6449
|
|
2.5
|
3
|
3260±841
|
21140±2945
|
11503±3878
|
12942±3592
|
|
5
|
4
|
2398±477
|
28562±5242a
|
17260±3505b
|
16361±2947a
|
|
10
|
3
|
2704±493
|
23179±3472
|
12779±3234
a
|
14407±4805
|
|
20
|
3
|
1917±425
|
17998±1090
|
6219±1773
|
10016±2588
|
注：與對照組比較 a: P<0.05;
b: P<0.01
2.4 體內促進IL-2產生
給小鼠皮下注射FCD[5rng及10mg/(kg·d)]9d后，脾細胞產生IL-2的能力明顯增強(表3)，以5mg/kg為最佳劑量。
表3
FCD在體內對小鼠脾細胞產生IL-2的影響
|
組別
（mg/kg）
|
No
|
IL-2活性
3H-TdR摻入（cpm，x±s）
|
|
1:2
|
1:4
|
1:8
|
|
Control
|
3
|
2957±2002
|
1860±7434
|
1576±695
|
|
FCD 5
|
4
|
9311±2790a
|
5063±1178
a
|
2504±1102
|
|
FCD 10
|
4
|
5534±2353
|
3294±1732
|
2217±1084
|
注： 反應細胞對照 cpm =
238±63
Con A對照（反應細胞+Con A）cpm
= 889±121
與FCD 10
mg/kg 組比較 a: P<0.05
FCD在體外無誘性IL-2作用(數據省略)。
2.5 體外誘導IFN產生
在脾細胞培養液中加入不同濃度的FCD，觀察培養(48h)后IFN產生情況，FCD在15～120μg/mL濃度范圍內均可誘生IFN，以60μg/mL誘生作用最強。在與LPS相同濃度時誘生IFN效應相似。此IFN經酸(PH2.0，4℃
24h)、加熱(56℃，1h)處理后活性消失，屬IFN-γ。
2.6 促進對SRBC的初次抗體應答
小鼠隨機分為4組，FCD劑量為5mg/(kg·d)。I組：皮下注射生理鹽水9d(對照組)；П組：連續給藥9d，給藥4d后SRBC免疫注射，Ш組：先給藥4d，SRBC免疫后停止給藥，改用生理鹽水；Ⅳ組：先給生理鹽水4d，SRBC免疫后給藥4d。各組動物皆在實驗9d后處死，取脾細胞用QHS法測定對SRBC的抗體量。結果如表4所示，FCD以3種給藥方式均可促進抗體產生(P
<0.05)。以第Ⅳ組給藥方式作用最為明顯(P <0.01)。給藥動物脾臟和胸腺重量有增加趨勢，但無統計學意義。
表3
FCD體內給藥促進小鼠對SRBC的初次抗體應答
|
組別
（mg/kg）
|
No
|
免疫后反映（x ± s）
|
|
抗體水平（OD413）
|
脾指數
|
胸腺指數
|
|
I
|
4
|
0.95±0.12
|
1.48±0.21
|
0.39±0.06
|
|
П
|
6
|
1.16±0.13
a
|
1.52±0.49
|
0.38±0.07
|
|
Ш
|
5
|
1.19±0.10
a
|
1.36±0.19
|
0.46±0.08
|
|
Ⅳ
|
5
|
1.33±0.17
b
|
1.59±0.35
|
0.42±0.04
|
注：與對照組比較 a: P<0.05;
b: P<0.01
3 討論
FCD是小鼠B細胞多克隆激活劑，在體外對T細胞無明顯刺激效應[10]。在體內，FCD可增強T細胞對Con
A、PHA的反應性，促進Con A誘導IL-2產生，這可能是FCD激活Me、NK和B細胞，由這些細胞釋放活性物質作用的結果，也有可能是FCD經代謝后對T細胞的直接作用。FCD可直接誘導小鼠脾細胞產生IFN，這與刺五加甙或甘草甜素等一些中藥的促誘生或協同作用明顯不同[11，12]。
FCD在體內外都具有誘導Me產生IL-1的作用。
FCD和LPS部主要作用于小鼠B細胞。文獻報道LPS在SRBC免疫前給與可抑制抗體產生，如果在SRBC免疫后給與，則表現為促進效應[13]。為此，我們選擇了3種給藥方式觀察FCD對抗體產生的影響。實驗結果表明3種給藥方式均可促進抗體產生，揭示FCD在體內的作用機制可能與LPS存在一定差異。
綜合本文和我們另文[10]報道結果以及有關FCD抗凝血效應方面的實驗資料(張冀伸等，未發表資料)，我們認為FCD可望開發為一種既能增強機體免疫功能，又能防治血栓病的有效藥物。
參考文獻
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