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          巖藻聚糖硫酸酯
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            詳說巖藻聚糖硫酸酯
            相關研究文獻資料

      1、巖藻聚糖和巖藻多糖的結構與功能的研究

      2、巖藻聚糖硫酸酯降血脂及抗氧化作用的研究

      3、褐藻糖膠的免疫調節作用
      4、褐藻糖膠治療動脈粥樣硬化臨床觀察
         藥效急性毒性實驗報告
      1、褐藻多糖硫酸酯與功能主治有關的主要藥效學試驗資料
      2、褐藻多糖硫酸酯藥效實驗結果

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

       

            
                     褐藻糖膠的免疫調節作用

       楊曉林  孫菊云  許漢年  劉曉慧  張翼伸  張紹倫
                              (白求恩醫科大學  長春 130021)

         摘 要  觀察了從海帶中提取的褐藻糖膠對小鼠免疫功能的影響。褐藻糖膠在體外可誘導白細胞介素-1(IL-1)和丙型干擾索(IFN-γ)產生;體內給藥可增強T細胞、B細胞、巨噬細胞(Me)和自然殺傷細胞(NK細胞)功能,促進對綿羊紅細胞(SRBC)的初次抗體應答。
         關鍵詞  褐藻糖膠;免疫調節
         文獻報道,褐藻門(Phaeophyte)一些藻類的多糖成分有明顯的抗腫瘤作用[1-3].但有關其免疫效應的研究則報道甚少,本研究初步觀察了從海帶中提取的褐藻糖膠對小鼠免疫功能的影響,對其作用機制進行探討,為褐藻多糖類免疫調節劑的深入研究和海藻資源的綜合開發利用提供實驗依據。

      1  材料與方法
      1.1 實驗動物
         C57 BL/6進交系小鼠,18~22g,雌雄不限;Swiss小鼠,18~25g,雌雄各半。均由本校實驗動物部提供.
      1.2 褐藻糖膠 (Funcoidan,FCD)
            FCD是從產于渤海灣海帶(Laminariu japonica Aresh)中提取的一種水溶性多糖[4]粉末,體內用藥時用生理鹽水配制,體外實驗用藥時用IMDM培養液配成所需濃度。采用加熱(60℃~80℃ 2h)或微孔濾膜(0.22~0.45μrn)除菌后備用。
      1.3 主要試劑
         IMDM培養基;GIBCO產品;Con A:Sigma產品;植物血凝素(PHA),上海醫學化驗所;細菌脂多糖(LPS):本室自制;3H-TdR:中科院北京原子能研究所。
      1.4  病毒和細胞株
         濾泡性口炎病毒(VSV):本校第一臨床學院傳染科提供;YAC-1細胞株:醫科院基礎所免疫室惠贈;L929細胞株:軍科院流研所惠贈。
      1.5  實驗方法
      1.5.1  IL-l和IL-2的誘生及活性測定   參照文獻[5,6]方法進行。
      1.5.2  1FN的誘生及活性測定    參照文獻[7],采用L929(VSV)系統測定其活性,按直接插入法計算效價。
      1.5.3  脾細胞介導的SRBC溶血分光光度計定量測定法(QHS) 參照文獻[8]。 }
      1.5.4  NK細胞活性檢測[9]
      1.5.4.1  效應細胞  無菌制備小鼠脾細胞懸液,低滲法破壞紅細胞后,用培養液調細胞數為1×107/mL或2×107/mL。
      1.5.4.2  靶細胞標記  取連續傳代3d以上生長狀態良好的YAC-1細胞配成1×106/mL,加入3H-TdR 25μCi/mL,經37℃溫育4h,每30min振蕩一次,標記后細胞用培養液洗3次,調細胞數為1×105/mL。靶細胞標記率一般可達0.3~0.6cpm/細胞。
      1.5.4.3  活性測定   采用96孔培養板,效靶比100:1。體外實驗時實驗孔加入不同濃度的FCD50μL(2.40~3.75μg/mL),設Con A、LPS和陰性對照孔,每孔加入標記細胞1×104/100μL,再加效應細胞1×106/50μL。體內給藥實驗時,每孔加標記細胞后,再加效應細胞1×106/100μL,體內、外實險均設靶細胞對照,以培養液代替效應細胞。置CO2孵箱培養24h,收獲細胞測定cpm值,結果以百分率表示,按下列公式計算:
         自然釋放率=(1—自然釋放孔cpm/總釋放孔cpm)×100%
            特異性釋放率=(1—實驗孔cpm/自然釋放孔cpm) ×100%
      2  結果
      2.1 誘導和促進IL-l產生
      2.1.1  Me在體外經不同濃度FCD作用48h,IL-l樣活性物質的分泌明顯增強(表1)。30μg/mL以上濃度的FCD與LPS10μg/mL的作用相近。

           1  FCD在體外誘導小鼠腹腔Me產生IL-l

      培養條件 μg/mL

      IL-l活性

      3H-TdR摻入(cpm,x±s)

      培養液稀釋濃度

      1:20

      1:40

      1:80

      IMDM

      5892±1332

      9374±1854

      8067±1620

      LPS(10)

      12207±2063

      11014±2207

      13263±1784

      FCD(240)

      10614±1784

      12342±5724

      15793±2877

          (60)

       

      13992±1595

      13900±212

      (30)

      13350±1536

      12289±2896

      10430±2805

          (15)

      10630±513

      12262±2406

      6128±3252

          (7.5)

      10714±2715

      11084±2401

      5998±1252

             注:胸腺細胞對照 cpm= 270±53
                               Con A對照(胸腺細胞+Con A)cpm = 5768±1856

      2.1.2 小鼠皮下注射FCD[10mg/(kg·d)] 9d后,腹腔Me產生IL-l樣活性物質的能力增強,給藥組動物腹腔Me,培養48h,培養上清液在1:80稀釋時可使胸腺細胞3H-TdR摻入值提高39% (P<0.05)。
      2.2  增強NK細胞活性
      2.2.1  在FCD對靶細胞(YAC-1)無明顯毒性的濃度范圍內,體外觀察其對小鼠脾臟NK細胞的作用,FCD3.75~240μg/mL均表現為激活NK細胞的效應,特異性釋放率增加7%~16%,最佳濃度為30μg/mL,480μg/mL濃度時則表現為抑制作用。
      2.2.2  小鼠皮下注射FCD 9d后,檢測其脾臟NK細胞活性,在2.5、5、10mg/(kg
      ·d)劑量時NK細胞活性顯著增強(P<0.05),在20mg/(ke·d)劑量時NK活性受列抑制(P<0.01)。
      2.3  增強絲裂原誘導的增殖反應
         給小鼠連續皮下注射FCD 9d后,觀察脾細胞對絲裂原(Con A、PHA、LPS)的反應性,結果如表2所示,FCD在0.25~10mg/(kg·d)劑量范圍內均表現有增強作用,以5mg/kg為最佳劑量,20mg/kg劑量時無明顯作用。
          2   FCD在體內給藥對有絲分裂原誘導增殖反應的影響

      組別 (mg/kg)

      No

      3H-TdR摻入(cpm,x±s)

      有絲分裂原

      ——

      Con A

      PHA 2.5

      LPS 15

      Control  

      4

      1739±311

      15189±5082

      7255±889

      10223±3847

      0.25     

      4

      2409±785

      17602±6462

      14046±3583a

      13335±6449

      2.5      

      3

      3260±841

      21140±2945

      11503±3878

      12942±3592

      5       

      4

      2398±477

      28562±5242a

      17260±3505b

      16361±2947a

      10      

      3

      2704±493

      23179±3472

      12779±3234 a

      14407±4805

      20      

      3

      1917±425

      17998±1090

      6219±1773

      10016±2588

      注:與對照組比較   a: P<0.05;   b: P<0.01
      2.4 體內促進IL-2產生
         給小鼠皮下注射FCD[5rng及10mg/(kg·d)]9d后,脾細胞產生IL-2的能力明顯增強(表3),以5mg/kg為最佳劑量。
            3   FCD在體內對小鼠脾細胞產生IL-2的影響

      組別
      mg/kg)

      No

      IL-2活性           3H-TdR摻入(cpm,x±s)

      1:2

      1:4

      1:8

      Control

      3

      2957±2002

      1860±7434

      1576±695

      FCD  5

      4

      9311±2790a

      5063±1178 a

      2504±1102

      FCD  10

      4

      5534±2353

      3294±1732

      2217±1084

      注: 反應細胞對照 cpm = 238±63
        
      Con A對照(反應細胞+Con A)cpm = 889±121
         FCD 10 mg/kg 組比較 a: P<0.05
              FCD在體外無誘性IL-2作用(數據省略)。
      2.5 體外誘導IFN產生
         在脾細胞培養液中加入不同濃度的FCD,觀察培養(48h)后IFN產生情況,FCD在15~120μg/mL濃度范圍內均可誘生IFN,以60μg/mL誘生作用最強。在與LPS相同濃度時誘生IFN效應相似。此IFN經酸(PH2.0,4℃ 24h)、加熱(56℃,1h)處理后活性消失,屬IFN-γ。
      2.6  促進對SRBC的初次抗體應答
         小鼠隨機分為4組,FCD劑量為5mg/(kg·d)。I組:皮下注射生理鹽水9d(對照組);П組:連續給藥9d,給藥4d后SRBC免疫注射,Ш組:先給藥4d,SRBC免疫后停止給藥,改用生理鹽水;Ⅳ組:先給生理鹽水4d,SRBC免疫后給藥4d。各組動物皆在實驗9d后處死,取脾細胞用QHS法測定對SRBC的抗體量。結果如表4所示,FCD以3種給藥方式均可促進抗體產生(P <0.05)。以第Ⅳ組給藥方式作用最為明顯(P <0.01)。給藥動物脾臟和胸腺重量有增加趨勢,但無統計學意義。
         3    FCD體內給藥促進小鼠對SRBC的初次抗體應答

      組別 mg/kg)

      No

      免疫后反映(x ± s)

      抗體水平(OD413)

      脾指數

      胸腺指數

      I

      4

      0.95±0.12

      1.48±0.21

      0.39±0.06

      П

      6

      1.16±0.13 a

      1.52±0.49

      0.38±0.07

      Ш

      5

      1.19±0.10 a

      1.36±0.19

      0.46±0.08

      5

      1.33±0.17 b

      1.59±0.35

      0.42±0.04

      注:與對照組比較   a: P<0.05;   b: P<0.01
      3 討論
         FCD是小鼠B細胞多克隆激活劑,在體外對T細胞無明顯刺激效應[10]。在體內,FCD可增強T細胞對Con A、PHA的反應性,促進Con A誘導IL-2產生,這可能是FCD激活Me、NK和B細胞,由這些細胞釋放活性物質作用的結果,也有可能是FCD經代謝后對T細胞的直接作用。FCD可直接誘導小鼠脾細胞產生IFN,這與刺五加甙或甘草甜素等一些中藥的促誘生或協同作用明顯不同[11,12]。
            FCD在體內外都具有誘導Me產生IL-1的作用。
        
      FCD和LPS部主要作用于小鼠B細胞。文獻報道LPS在SRBC免疫前給與可抑制抗體產生,如果在SRBC免疫后給與,則表現為促進效應[13]。為此,我們選擇了3種給藥方式觀察FCD對抗體產生的影響。實驗結果表明3種給藥方式均可促進抗體產生,揭示FCD在體內的作用機制可能與LPS存在一定差異。
         綜合本文和我們另文[10]報道結果以及有關FCD抗凝血效應方面的實驗資料(張冀伸等,未發表資料),我們認為FCD可望開發為一種既能增強機體免疫功能,又能防治血栓病的有效藥物。
      參考文獻
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      [3]  鄧槐春,等。海帶多糖的藥理作用。中草藥,1987;18:63
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      [5]  尚虹生,等。IL-1測定方法的探討及中藥香菇多糖對IL-1產生的作用。中國免疫學雜志,1986;2:270
      [6]  王興林,等。IL-1和比-2測定方法的某些改進.中國免疫學雜志,1080;5:106
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      [8]  楊貴貞主編,免疫學新進展專題講座。白求恩醫科大學,1987;200
      [9]  馮作化,陳兆聰。用3H-TdR標記的靶細胞檢測細胞介導的細胞毒作用。中國免疫學雜志,1988;4:73
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      [12]  馮勇山,等。甘草甜素對人脾細胞產生的
      γ-LFN影響。中華微生物學和免疫學雜志,1986;6: 99
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